1.准备工作，开水浴锅，预热试剂，超净工作台紫外照射30min,找到对应细胞在液氮罐中的位置

2.紫外照射后风机吹10min后，酒精擦拭台面，放入试剂和离心管，取15ml离心管，加入9ml培养液

3.在液氮罐中取出细胞，先拧松放液氮，再拧紧，将冻存管放入PE手套中，然后水浴融化后取出，1-2min

4.将冻存管喷酒精后放入超净台内，擦干管壁，用1ml枪头将细胞转移到已加培养液的离心管中

5.800-1000rpm离心5min,注意配平

6.将离心好的细胞弃上清，加入5ml完全培养基重悬，用移液管吹打8-10次，避免产生气泡，将细胞悬液接种到10cm培养皿中，补加5ml培养液

7.混匀，十字法或者8字法

8.将混好的细胞放入培养箱中培养

1.上述操作方案的数据可作为参考，实际操作已实验室配备的耗材为准，

2.冻存时含10%DMSO,事先加9ml培养液是为了稀释DMSO，理论上1%DMSO

对细胞无毒性

3.隔着PE手套能有效防止水浴过程中导致污染

4.重悬的体积只是作为参考，具体的根据需要可进行调整

5.由于复苏过程中已经离心，第二天可根据实际情况选择换液或者不换液（主要针对贴壁细胞）

1）复苏细胞：将含有 1mL9L-E细胞。悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加 入 4mL 培养基混合均 匀。在 1000RPM 条件下离心 4 分钟，弃去上清液，补 加 1-2mL 培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培 养过夜（或将 细胞悬液加入 10cm 皿中，加入约 8ml 培养基，培养过夜）。第二天换液并 检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达 80%-90%，即可进行传代培养。

1. 收到9L-E细胞。后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。
2. 仔细阅读9L-E细胞。说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致。若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。
3. 用 75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题贴壁细胞会有少量 从瓶壁脱落，将细胞置于培养箱内静置培养 4~6 小时,再取出观察。此时多数细胞均会贴壁，若细胞仍不能贴壁请用台盼蓝 染色测定细胞活力，如果证实细胞活力正常， 请将细胞离心后用新鲜培养基再次贴壁培养；如果染色结果显示细胞无活 力，请拍下 照片及时和我们联系，信息确认后我们为您再免费寄送一次。
4.静置细胞贴壁后，请将细胞瓶内的培养基倒出，留 6~8mL 维持细胞正常培养，待细 胞汇 合度80%左右时正常传代。
5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以 一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件。
6.建议客户收到9L-E细胞。后前3 天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和志伟技术部沟通交流。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和我们联系，告知细胞的具体情况，以便我们的技术人员跟踪回访直至问题解决。